Biotin a jeho aplikace v molekulární biologii

Biotin je malá molekula rozpustná ve vodě. S jeho postranním řetězcem se snadno manipuluje, aby se napojil na jiné biomolekuly, což vede k biotinylaci (také známé jako značení biotinu). Tyto jedinečné fyzikálně-chemické vlastnosti dělají z biotinu zajímavý mediátor propůjčující schopnost biotinylovaných cílů interagovat s avidinem nebo streptavidinem. Vysokoafinitní biotin-(strept)avidinová vazba se široce používá při detekci a separaci cílových proteinů/buněk. Tyto aplikace zahrnují imunotesty (nejoblíbenější aplikace jsou ELISA a Westerny), afinitní chromatografie, pull-down testy, supramolekulární konstrukce, cílení rakovinných buněk pro dodávání léků a mnoho dalších. 

Aby bylo možné využít přirozené vazby biotinu a (strept)avidinu, musí být biomolekuly, které jsou předmětem zájmu, nejprve biotinylovány. Aby byla biotinylace pohodlnější, vědci vyvinuli několik metod biotinylace biomolekul. Jedním z nich je použití biotinylačních chemických činidel  in vitro . Exponovaný postranní řetězec biotinu může být zesíťován na funkční skupiny prostřednictvím specializovaných chemikálií. Byly použity různé chemikálie, které pomáhají biotinylovat cíl zájmu v různých mikroprostředích. Nejoblíbenější chemickou látkou pro biotinylaci proteinů je ester biotin-N-hydroxysukcinimidu (NHS) pro zacílení primárních aminů na cílové peptidy. 

Dalším oblíbeným způsobem biotinylace proteinu je použití enzymu BirA  in vitro  nebo  in vivo . BirA je  biotin ligáza E. coli  , která místně specificky biotinyluje lysinový postranní řetězec rozpoznáním 15-aminokyselinové peptidové sekvence nazývané Avi-Tag. V souladu s tím vědci vyvinuli různé vektory pro expresi Avi-Tag fúzních proteinů, ve kterých je Avi-Tag přidán buď na N nebo C konec proteinu. Následně se komerčně dostupný BirA inkubuje s rekombinantními proteiny, aby je enzymaticky biotinyloval  in vitro . Alternativně můžeme BirA použít také  in vivo ke katalýze proteinové biotinylace. Za tímto účelem bude BirA koexprimován s požadovaným proteinem fúzovaným s Avi-tag v buňkách bakterií, kvasinek, hmyzu a savců. Mějte prosím na paměti, že rozpustnost proteinu je rozhodující pro zajištění účinnosti biotinylace v   metodě in vivo .