CO JE LEPŠÍ, BSA vs. MLÉKO, ve WESTERN BLOT?

Blokující činidlo je nereagující látka používaná k zabránění nespecifické vazby vámi vybraných protilátek na nitrocelulózovou nebo PVDF membránu. Obecně má membrána na svém povrchu mnoho hydroxylových (OH) skupin, které pomáhají uchovat proteiny prostřednictvím hydrofobní interakce bez specifičnosti. Po přenosu proteinu jsou volné OH skupiny na membráně otevřené pro vazbu jakýchkoli proteinů včetně primárních protilátek, které budou aplikovány ve vašem WB testu, což způsobí nepřijatelné pozadí. Pro zmírnění potenciálního problému mohou proteinové složky v NFM nebo BSA pomoci vázat tyto volné OH skupiny a následně blokovat pozdější interakci primárních protilátek a OH skupin, což vede k mnohem čistšímu pozadí WB.

Když vytvoříte svůj blokovací pufr, koncentrace NFM nebo BSA může být přizpůsobena pro váš experiment mezi 1-5 %. Vždy je bezpečnější začít s nižší koncentrací a pomalu se propracovávat až k 5 %. U intenzivně se vážících protilátek pravděpodobně pomůže 5% koncentrovaný NFM nebo BSA významně eliminovat ty falešně pozitivní nálezy. Koncentrace vyšší než 5 % se nedoporučuje, protože váš cílový protein také riskuje zablokování.

Zde najdete více informací a shrnutí diskuse do tabulky, která poskytuje průvodce, který vám pomůže navrhnout experiment.